OBJETIVOS: Demostrar de manera cuantitativa la muerte de las Células β de los islotes pancreáticos en pacientes con DM1 mediante el ensayo ddPCR para discriminar especificamente la insulina metilada de ADN de la insulina no metilada como indicador de muerte de dichas células.
MUESTRA BIOLÓGICA: 200μl de suero y tejidos utilizando sangre de ADN de Qiagen y kit de tejido en 3 tipos de sujetos: Pacientes no diabéticos de control (control de calidad), pacientes con DM1 en su primer año de diagnóstico y sujetos en riesgo, es decir familiares de personas con DM1.
TIPO DE ÁCIDO NUCLEÍCO: ADN de Qiagen y kit de tejido. El ADN aislado se trató con bisulfito utilizando el kit de metilación EZ DNA.
GEN A AMPLIFICAR: Gen de la insulina humana (hg19 conocido - Gen uc021qcd.1 rango chr11: 2181009-2182439) en los nucleótidos 21814010 y 21814012 que son 396 y 399 de el TSS.
TIPO DE PCR: PCR Digital en gotitas (ddPCR) se realizó en un termociclador a 95ºC por 10 minutos
D: 94ºC por 30 segundos
H: 58ºC por 60 segundos
E: 98ºC por 10 minutos
VISUALIZACIÓN: La placa de PCR se transfirió a un lector de gotas QX100 y los productos fueron analizados por el software de análisis QuantaSoft. La discriminación de gotitas que contenían el objetivo (positivas) y las que no (negativos) se lograron con fluorescencia.
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD ANALÍTICA: Sensibilidad y especificidad del 95% para discriminación de individuos con DM1.
Normalmente en muchas células β el INS ADN se metila y no se transcribe por lo que sirvió como detección en muestras de suero para análisis de PCR en tiempo real, sin embargo su concentración era muy baja y la presencia de artefactos no resultó como un método eficiente, razón por la cual se aplicó PCR Digital en gotitas (ddPCR) mediante la cuantificación de INS ADN no metilado concentrado en los islotes de Langgerhans, significa la cantidad de células β que han muerto. Los resultados más relevantes del estudio indican que los valores de INS ADN no metilado eran significativamente mayores en el suero de pacientes de diagnóstico reciente de DM1 (1er año) que los pacientes de control. Pero fue aún más importante el hallazgo en Pacientes con Riesgo de DM1 (familiares) donde se reflejó que sus mediciones de INS ADN eran elevadas; El ensayo de Net Pathway To Prevention identificó que era como tener 70% de riesgo a DM1 durante 5 años, sin embargo no habían sido diagnósticados porque era normoglicémicos y con niveles normales de HbA1c.
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