OBJETIVOS: Identificar genes y mecanismos moleculares que controlan la función de la células T diabetogénicas realizando un Microarray de ADN en células CD4 + específicas de islotes de ratones BDC2.5 TCR transgénicos que contiene el Idd9locus de ratones NOD suceptibles a DM1 o ratones C57BL/10 resistentes a DM1.
MUESTRA BIOLÓGICA: Se utilizaron ratones BDC hembras libres de diabetes (control de calidad) y ratones BDC-Idd9.905 NOD recientemente generados como donantes de células T CD4. Utilizaron 3 replicas biológicas independientes para cada afección en el análisis de microarray de ADN.
TIPO DE ÁCIDO NUCLEÍCO: Extracción de ARN. El ARN total se extrajo de células T CDV + TCRVβ4 +BDC y BDC-Idd9.905 ex vivo o estimuladas con p79 utilizando kit RNearsy (Qiagen). El ARN medilizado se sintetizó mediante amplificación TotalPrep.
GEN A AMPLIFICAR: BDC-Idd9.905 vs. BDC Células T CD4+
TIPO DE PRUEBA: Análisis de Microarray de ADN de células T CD4
Expresión de BeadChips: 58ºC por 18 horas según instrucciones del fabricante
Hibridación: Después de hibridación los BeadChips se lavaron y se marcaron con fluorescencia. Se procesaron 3 hibridaciones de microarray replicados independientes por cepa y condición (12 hibridaciones en total)
Datos de intensidad: Se escanearon los BeadChips con Lector BeadArray (Ilumina)
VISUALIZACIÓN: Los resultados se exportaron a GeneSpring Gx11 (Agilent Technologies) para analizar datos de expresión que normalizó al nivel de expresión temático de cada gen. p-valueb0 se consideró marginal. Las transcripciones se filtraron para nivel de señal N100 en mínimo el 50% de los valores de cada una de las 6 muestras de cada condición. Las expresiones que no cumpleron se excluyeron del análisis.
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