Prueba Molecular en Diabetes tipo 1: Microarray de ADN en células T CD4

TEMA: Identificación de genes candidatos de Diabetes Tipo 1 mediante análisis de microarrays de ADN de células T CD4 más específicas de los islotes.

OBJETIVOS: Identificar genes y mecanismos moleculares que controlan la función de la células T diabetogénicas realizando un Microarray de ADN en células CD4 + específicas de islotes de ratones BDC2.5 TCR transgénicos que contiene el Idd9locus de ratones NOD suceptibles a DM1 o ratones C57BL/10 resistentes a DM1.

MUESTRA BIOLÓGICA: Se utilizaron ratones BDC hembras libres de diabetes (control de calidad) y ratones BDC-Idd9.905 NOD recientemente generados como donantes de células T CD4. Utilizaron 3 replicas biológicas independientes para cada afección en el análisis de microarray de ADN.

TIPO DE ÁCIDO NUCLEÍCO: Extracción de ARN. El ARN total se extrajo de células T CDV + TCRVβ4 +BDC y BDC-Idd9.905 ex vivo o estimuladas con p79 utilizando kit RNearsy (Qiagen). El ARN medilizado se sintetizó mediante amplificación TotalPrep.

GEN A AMPLIFICAR: BDC-Idd9.905 vs. BDC Células T CD4+

TIPO DE PRUEBA: Análisis de Microarray de ADN de células T CD4

      Expresión de BeadChips: 58ºC por 18 horas según instrucciones del fabricante
      Hibridación: Después de hibridación los BeadChips se lavaron y se marcaron con fluorescencia. Se procesaron 3 hibridaciones de microarray replicados independientes por cepa y condición (12 hibridaciones en total)
      Datos de intensidad: Se escanearon los BeadChips con Lector BeadArray (Ilumina)

VISUALIZACIÓN: Los resultados se exportaron a GeneSpring Gx11 (Agilent Technologies) para analizar datos de expresión que normalizó al nivel de expresión temático de cada gen. p-valueb0 se consideró marginal. Las transcripciones se filtraron para nivel de señal N100 en mínimo el 50% de los valores de cada una de las 6 muestras de cada condición. Las expresiones que no cumpleron se excluyeron del análisis.

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD ANALÍTICA: No especificada

Referencias Bibliográficas

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4583664/pdf/main.pdf

Prueba de PCR en Diabetes Tipo 1: Muerte de Células β

TEMA: Análisis de la muerte de células Beta en la Diabetes Tipo 1 por PCR Digital en gotitas.

OBJETIVOS: Demostrar de manera cuantitativa la muerte de las Células β de los islotes pancreáticos en pacientes con DM1 mediante el ensayo ddPCR para discriminar especificamente la insulina metilada de ADN de la insulina no metilada como indicador de muerte de dichas células.

MUESTRA BIOLÓGICA: 200μl de suero y tejidos utilizando sangre de ADN de Qiagen y kit de tejido en 3 tipos de sujetos: Pacientes no diabéticos de control (control de calidad), pacientes con DM1 en su primer año de diagnóstico y sujetos en riesgo, es decir familiares de personas con DM1.

TIPO DE ÁCIDO NUCLEÍCO: ADN de Qiagen y kit de tejido. El ADN aislado se trató con bisulfito utilizando el kit de metilación EZ DNA.

GEN A AMPLIFICAR: Gen de la insulina humana (hg19 conocido - Gen uc021qcd.1 rango chr11: 2181009-2182439) en los nucleótidos 21814010 y 21814012 que son 396 y 399 de el TSS.

TIPO DE PCR: PCR Digital en gotitas (ddPCR) se realizó en un termociclador a 95ºC por 10 minutos

D: 94ºC por 30 segundos
H: 58ºC por 60 segundos
E: 98ºC por 10 minutos

VISUALIZACIÓN: La placa de PCR se transfirió a un lector de gotas QX100 y los productos fueron analizados por el software de análisis QuantaSoft. La discriminación de gotitas que contenían el objetivo (positivas) y las que no (negativos) se lograron con fluorescencia.

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD ANALÍTICA: Sensibilidad y especificidad del 95% para discriminación de individuos con DM1.



Normalmente en muchas células β el INS ADN se metila y no se transcribe por lo que sirvió como detección en muestras de suero para análisis de PCR en tiempo real, sin embargo su concentración era muy baja y la presencia de artefactos no resultó como un método eficiente, razón por la cual se aplicó PCR Digital en gotitas (ddPCR) mediante la cuantificación de INS ADN no metilado concentrado en los islotes de Langgerhans, significa la cantidad de células β que han muerto. Los resultados más relevantes del estudio indican que los valores de INS ADN no metilado eran significativamente mayores en el suero de pacientes de diagnóstico reciente de DM1 (1er año) que los pacientes de control. Pero fue aún más importante el hallazgo en Pacientes con Riesgo de DM1 (familiares) donde se reflejó que sus mediciones de INS ADN eran elevadas; El ensayo de Net Pathway To Prevention identificó que era como tener 70% de riesgo a DM1 durante 5 años, sin embargo no habían sido diagnósticados porque era normoglicémicos y con niveles normales de HbA1c.

Referencias Bibliográficas

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25004096