Técnica de Edición Epigenómica: Biomarcadores de Diagnóstico epigenético en Diabetes Tipo 1 y uso de Epidrogas

Los miRNAs circulantes son biomarcadores potenciales de DM1. La detección de miRNAs séricos ha determinado por ejemplo que el miR-375 es el biomarcador para la actividad de células Beta en humanos, o que el aumento de miR-326 y disminución de miR-146, iR-21a y miR-93 se correlacionan con autoinmunidad en el islote pancreático. Además de ello se realizaron PCR de metilacion de células beta humanas para caracterizar el inicio de la desregulación metabólica y detrucción beta para predecir la evolución de la DM1. Como tratamiento a DM1 o por lo menos como reducción de la carga de enfermedad se han usado miRNAs que mejoran la efectividad del remplazo de células beta mediante procedimientos con células madre pluripotentes inducidaa en trasplantes de islotes.

Los compuestos epigenéticos que podrían ser potenciales nuevos fármacos llamados EPIDRUGS. 
En el siguiente cuadro se observa la epidroga, el organismo al que se aplico y los comentarios y efectos que tuvo la epidroga.

 

 Referencias Bibliográficas  

1. https://www.redaccionmedica.com/secciones/industria/el-futuro-de-la-diabetes-pasa-por-la-epigenetica-6439

2. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931524417301901

Técnica de Edición Genómica: Reprogramación de la función y especificidad de las células T humanas con la orientación del genoma no viral

Mediante un sistema de seleccion de genomas CRISPR-Cas9 que no requiere vectores virales se inserta rapida y eficientemente secuencias de ADN grandes, más de un kb, a sitios de genomas de células T humanas. Se aplicó para corregir la mtación patógena de IL2RA, mismo gen que en la DM1 normalmente deberia codificar al receptor IL-2 (interleucina 2) en las células T reguladoras lo que conduce a una supresión de linfocitos T y a su apoptosis, sin embargo la carencia de IL-2 en pacientes con DM1 produce linfoproliferación y la depleción de células T reg lo que favorece al desarrollo de la enfermedad autoinmune. El metodo puede usar células frescas o crioconservadas de células T y células de sangre total o leucoféresis. La fusión de CD4-GFP fue expresado en las células T CD4. Estos resultados demuestran que varios genes endógenos pueden ser ingeniería directa sin virus en las células T y ese gen y proteína conservan los reglamentos. 

 

Con la orientación del genoma no viral  se pudo corregir la mutación y se observó que la expresión de del receptor IL-2 en la superficie de las células T estaba corregido gracias a las plantillas largas de dsADN. 

Referencias Bibliográficas

1. https://www.nature.com/articles/s41586-018-0326-5

2. https://www.revistanefrologia.com/es-genetica-diabetes-mellitus-articulo-X2013757511002452

Terapia con Stem Cells: La dirección del tráfico de células madre en el páncreas invierte la diabetes tipo 1

Investigadores de Harvard han tenido éxito en el uso de Stem Cells en el páncreas, debido a la fragilidad del órgano y a que el ingreso de sustancias al mismo provoca liberación de toxinas se ha creado una molécula de localización HCELL para guiar a las células madre hacia los islotes pancreáticos inflamados. Los MSC´s son un tipo de células madres adultas con potentes efectos antinflamatorios e inmunosupresores, los ensayos preclínicos se realizaron en ratones diabéticos no obesos y se reconoció que la administración intravenosa de estas células madre amortigua la lesión pancreática disminuyendo la glucemia en ratones que no se ha administrado insulina, aunque los efectos son temporales se tiene como hipótesis que los MSC´s podrían ser forzados a poblar el páncreas y así lograr disminuir la destrucción inmune que sufren los pacientes con DM1 debido a la porvocación de una reversión completa de la destrucción de los islotes pancreáticos por lo que esta terapia sigue siendo motivo de estudio.

Las células madre mesenquimales (verdes) colonizan un islotes pancreáticos en un modelo preclínico de diabetes. Los puntos azules representan los núcleos de las células dentro del islote.

Referencias Bibliográficas

1. https://cells4life.com/type-1-diabetes-and-stem-cells/

2. https://news.harvard.edu/gazette/story/2015/01/steering-stem-cell-trafficking-into-pancreas-reverses-type-1-diabetes/

Animales transgénicos en Diabetes Tipo 1. Ventajas y Desventajas de los Transgénicos en general.

Regeneración de páncreas en animales transgénicos 

Se demostro que ratones transgénicos diabéticos han logrado regenerar su páncreas destruido, recuperarse y mantenerse sanos. Manipularon genéticamen a un embrión de ratón microinyectandole el gen IGF-1 (factor de crecimiento similar a la insulina-1). Tras inducirceles a diabetes expermiental, pudieron los ratones revertir completamente la enfermedad porque a los 3 meses se observo que la masa de células beta se habían recuperado en transgénicos mientras que en ratones no transgénicos se habían reducido hasta más del 90%. El gen condujo a que las células beta aun no destruidas se replicaran y que las células madre que existen en los conductos del páncreas crearan nuevas células. Al mismo tiempo, la existencia del gen ha contrarrestado la destrucción de las nuevas células. Y se considera que el gen IGF-1 a futuro pueda ser un buen candidato para terapia génica en DM1. Debido a los resultados favorables ahora trabajan en la manipulación genética de páncreas in vivo de ratones y perros diabéticos.

Ventajas y Desventajas de los Trangénicos 

Desventajas:

1.  Productos alimenticios procesados con presencia de moléculas cancerígenas.
2.  La manipulación genética en animales puede llegar a tal punto en que se vuelva incontrolable y recaiga en la creación de enfemerdades que no se entiendan y no se puedan tratar.
3. Introducir genes extraños en los alimentos puede conducir a alergias en humanos.
4. Alteración del los ecosistemas debido al ingreso de agentes o genes manipulados que puedan destruir la diversidad modificando el equilibrio ecológico.
5. A largo plazo se puede dar el caso de la aparición de super plagas debido a genes de resitencia  incluidos en plantas.

Ventajas:

1. La manipulación de vegetales y plantas ha conducido a la mejor resistencia ante plagas.
2. Aumento de producción vegetal y animal a través de uso de organismos transgénicos.
3. Simulación de enfermedades en animales para comprender y mejorar el tratamiento en humanos.
4. Reducción del rechazo biológico, por ejemplo compatibilidad de casi el 100% en el caso de la insulina producida por E. coli.
5. Verduras con mayor presencia en cantidad y calidad de vitaminas y minerales.  

Referencias Bibliográficas

1. https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/3532/mgp1de1.pdf?sequence=1&isAllowed=y
2. https://elpais.com/diario/2002/05/07/salud/1020722401_850215.html
3. https://medium.com/@miguelmehrgutpalenzuela/ventajas-y-desventajas-plantas-transg%C3%A9nicas-48ffb1711fca
4.  https://www.ecologiaverde.com/ventajas-y-desventajas-de-los-alimentos-transgenicos-1073.html

ADN Recombinante en la Naturaleza y para la Producción de Insulina

ADN Recombinante

• en la Naturaleza: Las Bacterias a través del proceso de transformación sufren recombinaciones genéticas que les permiten la transferencia de genes en especies diferentes. de manera que las bacterias pueden atrapar el ADN libre del entorno que las rodea, donde dicho ADN libre pudo pertenecerle al cromosoma de otra bacteria. El ADN libre puede deberse a que una bacteria ha muerto y por ello libera su ADN para que lo capte otra bacteria. Otra manera de recombinación de ADN en bacterias es mediante el uso de plásmidos, moléculas circulares de ADN bacteriano presente en algunos protistas, algas y hongos, en dichos plásmidos en ocasiones se puede transmitir la resistencia farmacológica entre bacterias incluso de diferentes especies.
  
  
  
• por Ingeniería Genética: La Insulina Lispro fue la primera sustancia análoga a la insulina cuyo origen fue de ADN recombinante, mediante la inversión de los aminoácidos prolina y lisina en las posiciones 28 y 29 de la cadena B de la molécula de insulina humana. El cambio de lugar de los aminoácidos produce una variación en el carbono terminal, que impide la capacidad de formar dimeros de insulina. Así la Insulina lispro tiene un inicio rápido de acción (5-15min) y una duración reducida (2-4h) fue diseñada con el propósito de imitar la concentración fisiológica de insulina en la sangre en respuesta a la glucemia postprandial. Se observón en Diabéticos tipo 1 péptido C negativo, que el tiempo de concentraciñon máxima de insulina lispro fue de 41 ± 4 min.
  

  Referencias Bibliográficas

  1. http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1561-29532006000300005&script=sci_arttext

  2. https://cdn.educ.ar/dinamico/UnidadHtml__get__3115e6c3-7a08-11e1-805a-ed15e3c494af/index.html

  3. http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/GeneticaBacteriana.pdf

Prueba Molecular en Diabetes tipo 1: Microarray de ADN en células T CD4

TEMA: Identificación de genes candidatos de Diabetes Tipo 1 mediante análisis de microarrays de ADN de células T CD4 más específicas de los islotes.

OBJETIVOS: Identificar genes y mecanismos moleculares que controlan la función de la células T diabetogénicas realizando un Microarray de ADN en células CD4 + específicas de islotes de ratones BDC2.5 TCR transgénicos que contiene el Idd9locus de ratones NOD suceptibles a DM1 o ratones C57BL/10 resistentes a DM1.

MUESTRA BIOLÓGICA: Se utilizaron ratones BDC hembras libres de diabetes (control de calidad) y ratones BDC-Idd9.905 NOD recientemente generados como donantes de células T CD4. Utilizaron 3 replicas biológicas independientes para cada afección en el análisis de microarray de ADN.

TIPO DE ÁCIDO NUCLEÍCO: Extracción de ARN. El ARN total se extrajo de células T CDV + TCRVβ4 +BDC y BDC-Idd9.905 ex vivo o estimuladas con p79 utilizando kit RNearsy (Qiagen). El ARN medilizado se sintetizó mediante amplificación TotalPrep.

GEN A AMPLIFICAR: BDC-Idd9.905 vs. BDC Células T CD4+

TIPO DE PRUEBA: Análisis de Microarray de ADN de células T CD4

      Expresión de BeadChips: 58ºC por 18 horas según instrucciones del fabricante
      Hibridación: Después de hibridación los BeadChips se lavaron y se marcaron con fluorescencia. Se procesaron 3 hibridaciones de microarray replicados independientes por cepa y condición (12 hibridaciones en total)
      Datos de intensidad: Se escanearon los BeadChips con Lector BeadArray (Ilumina)

VISUALIZACIÓN: Los resultados se exportaron a GeneSpring Gx11 (Agilent Technologies) para analizar datos de expresión que normalizó al nivel de expresión temático de cada gen. p-valueb0 se consideró marginal. Las transcripciones se filtraron para nivel de señal N100 en mínimo el 50% de los valores de cada una de las 6 muestras de cada condición. Las expresiones que no cumpleron se excluyeron del análisis.

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD ANALÍTICA: No especificada

Referencias Bibliográficas

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4583664/pdf/main.pdf

Prueba de PCR en Diabetes Tipo 1: Muerte de Células β

TEMA: Análisis de la muerte de células Beta en la Diabetes Tipo 1 por PCR Digital en gotitas.

OBJETIVOS: Demostrar de manera cuantitativa la muerte de las Células β de los islotes pancreáticos en pacientes con DM1 mediante el ensayo ddPCR para discriminar especificamente la insulina metilada de ADN de la insulina no metilada como indicador de muerte de dichas células.

MUESTRA BIOLÓGICA: 200μl de suero y tejidos utilizando sangre de ADN de Qiagen y kit de tejido en 3 tipos de sujetos: Pacientes no diabéticos de control (control de calidad), pacientes con DM1 en su primer año de diagnóstico y sujetos en riesgo, es decir familiares de personas con DM1.

TIPO DE ÁCIDO NUCLEÍCO: ADN de Qiagen y kit de tejido. El ADN aislado se trató con bisulfito utilizando el kit de metilación EZ DNA.

GEN A AMPLIFICAR: Gen de la insulina humana (hg19 conocido - Gen uc021qcd.1 rango chr11: 2181009-2182439) en los nucleótidos 21814010 y 21814012 que son 396 y 399 de el TSS.

TIPO DE PCR: PCR Digital en gotitas (ddPCR) se realizó en un termociclador a 95ºC por 10 minutos

D: 94ºC por 30 segundos
H: 58ºC por 60 segundos
E: 98ºC por 10 minutos

VISUALIZACIÓN: La placa de PCR se transfirió a un lector de gotas QX100 y los productos fueron analizados por el software de análisis QuantaSoft. La discriminación de gotitas que contenían el objetivo (positivas) y las que no (negativos) se lograron con fluorescencia.

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD ANALÍTICA: Sensibilidad y especificidad del 95% para discriminación de individuos con DM1.



Normalmente en muchas células β el INS ADN se metila y no se transcribe por lo que sirvió como detección en muestras de suero para análisis de PCR en tiempo real, sin embargo su concentración era muy baja y la presencia de artefactos no resultó como un método eficiente, razón por la cual se aplicó PCR Digital en gotitas (ddPCR) mediante la cuantificación de INS ADN no metilado concentrado en los islotes de Langgerhans, significa la cantidad de células β que han muerto. Los resultados más relevantes del estudio indican que los valores de INS ADN no metilado eran significativamente mayores en el suero de pacientes de diagnóstico reciente de DM1 (1er año) que los pacientes de control. Pero fue aún más importante el hallazgo en Pacientes con Riesgo de DM1 (familiares) donde se reflejó que sus mediciones de INS ADN eran elevadas; El ensayo de Net Pathway To Prevention identificó que era como tener 70% de riesgo a DM1 durante 5 años, sin embargo no habían sido diagnósticados porque era normoglicémicos y con niveles normales de HbA1c.

Referencias Bibliográficas

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25004096